BAB I
PENDAHULUAN

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petrolium, namun Tswett yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapis tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasarnya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High performance Liquid Chromatography (HPLC) atau kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Performance = Tekanan atau kinerja tinggi, High Speed = kecepatan tinggi dan modern = moderen ) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam kedua instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.
 
Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer dan menjadi pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap reseptornya1,2,3).
Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut pemurnian satu tahap (one step purification). Prinsip kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik2). Dalam proses pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan suatu ligan. Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap. Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan adanya teknologi fusi protein3). Idenya adalah membuat suatu protein fusi yang terdiri dari protein yang akan dimurnikan dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan ligan tertentu. Pemurnian protein Mga yang dilakukan selama ini melalui banyak tahap, sehingga proses pemurnian tidak efisien. Protein Mga merupakan biomolekul yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas, sebab teknik ini dapat digunakan untuk secara spesifik memisahkan biomolekul tertentu dari bahan biologis yang merupakan campuran kompleks, yang biasanya tidak mudah untuk dipisahkan dengan menggunakan metode-metode lain3).
Pemurnian protein Mga menggunakan teknik kromatografi afinitas secara langsung tidak dapat dilakukan karena protein Mga ini tidak mempunyai ligan spesifik yang dapat mengikatnya. Dengan teknologi fusi protein dibuat protein fusi MBP-Mga yang terdiri dari protein Mga dan protein MBP yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan maltosa4,5). Pembuatan protein fusi dilakukan pada tingkat DNA, dengan menggabungkan gen mga49 dan malE6,7).
Tulisan ini melaporkan tentang cara memurnikan protein fusi MBP-Mga dengan teknik kromatografi afinitas. Tahap-tahap yang dilakukan meliputi tahap overproduksi protein MBP-Mga S. pyogenes dari E. coli pMALMga rekombinan, pemurnian protein fusi MBP-Mga dengan kromatografi afinitas, dan dilanjutkan karakterisasi dengan SDS-PAGE.


Metode Penelitian
2.1. Overekspresi gen mga49 dalam E. coli (pMALMga)
Bakteri E. coli yang mengandung plasmid pMALMga ditanam dalam medium LB (tripton 1% b/v, ekstrak ragi 0,5% b/v, NaCl 1% b/v dalam aquades) cair yang mengandung glukosa 0,2% b/v. Untuk overproduksi protein fusi MBP-Mga rekombinan, maka dilakukan induksi dengan penambahan 0,3 mM IPTG (Isopropil-β-D-tiogalaktosida) selama 2 jam. Sel dipanen dengan cara sentrifugasi, kemudian ditambah bufer sodium-tris-etilendiamintetraasetat (NaCl 5 M, EDTA 0,5 M, Tris-HCl 1 M), diresuspensi dan disentrifugasi kembali sebanyak dua kali. Pelet sel dilisis dengan sonikator, dan protein dipisahkan dari debris sel dengan cara sentrifugasi pada kecepatan tinggi. Protein yang diambil adalah protein yang berada dalam supernatan.

2.2. Pemurnian Protein Fusi MBP-Mga
Pemurnian protein fusi MBP-Mga dilakukan dengan kromatografi afinitas menggunakan kolom resin amilosa. Protein Mga yang dihasilkan sebagai protein fusi dengan pengikat maltosa dimasukkan ke dalam kolom amilosa dan diinkubasi selama 1-2 jam. Hal ini bertujuan agar protein fusi dapat menempel pada ligan. Kolom kemudian dicuci dengan bufer (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, dan EDTA 1 mM) sebanyak 50 X volume kolom dan 100 X volume kolom, untuk menghilangkan kontaminan. Selanjutnya protein dilepaskan dari ligan dengan mengalirkan bufer elusi (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, dan maltosa 10 mM) ke dalam kolom. Setiap 1,5 ml hasil elusi ditampung sebagai fraksi-fraksi yang diamati dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 280 nm.

2.3. Karakterisasi protein dengan elektroforesis SDS-PAGE
SDS PAGE yang digunakan adalah didasarkan atas sistem Laemmli3). SDS PAGE sistem Laemmli dilakukan dengan memakai empat komponen utama yaitu bufer elektroforesis, bufer sampel, separating gel dan stacking gel3). Pada penelitian ini yang digunakan adalah separating gel 12% (b/v), komposisinya adalah 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 100 μl SDS 10% (b/v), 4 ml larutan akrilamid/bis-akrilamid stock 30% b/v, 50 μl amonium persulfat 10% (b/v), 5 μl TEMED, dan 3,35 ml akuades. Stacking gel 4,0% (b/v), komposisinya adalah 2,5 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 100 μl SDS 10% (b/v), 1,33 ml larutan akrilamid/bis-akrilamid stock 30% b/v, 50 μl amonium persulfat 10% (b/v), 10 μl TEMED, dan 6,1 ml akuades.
Separating gel 12% (b/v) sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam alat pencetak lempengan gel dari Mini Protean II Bio Rad pada bagian bawah, setelah separating gel mengeras dimasukkan stacking gel 4,0% (b/v) sebanyak 2 ml di atas separating gel, lalu pada stacking gel yang masih cair dimasukkan sisir untuk membuat sumur. Sumur-sumur ini digunakan untuk memasukkan sampel protein yang akan dikarakterisasi pada gel.
Gel yang telah dipersiapkan dimasukkan ke dalam alat elektroforesis. Kemudian bufer elektroforesis di masukkan dalam tangki. Larutan sampel dengan jumlah protein MBP-Mga sekitar 20 μg dicampur dengan 10 μl bufer sampel, dididihkan selama 5 menit untuk mendenaturasi protein dan didinginkan pada suhu kamar. Campuran ini dan protein penanda ukuran dimasukkan ke sumur-sumur gel pada alat elektroforesis sebanyak maksimum 20 μl. Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 200 Volt selama 60 menit. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan larutan pewarna (staining). Gel hasil elektroforesis yang telah diwarnai dimasukkan ke dalam larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel yang tidak mengandung pita protein. Pita pada gel hasil elektroforesis tersebut didokumentasikan.

3. Hasil dan Diskusi
Pemurnian protein ekstrak kasar dari E. coli pMALMga yang mengandung protein fusi MBP-Mga dilakukan beberapa kali untuk menentukan kondisi optimum dalam mendapatkan protein murni. Protein fusi MBP-Mga hasil overekspresi dimurnikan menggunakan teknik kromatografi afinitas dengan kolom resin amilosa. Penggunaan amilosa sebagai ligan dimungkinkan karena maltose binding protein (MBP) mampu berikatan secara spesifik dengan maltosa sebagai dimer pada amilosa. Pemurnian ini dilakukan pada kondisi pH 7,4, dengan bufer pencuci (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, dan EDTA 1 mM) dan bufer pengelusi (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, dan maltosa 10 mM).
Pemurnian terhadap protein ekstrak kasar E. coli pMALMga hasil overekspresi dilakukan masing-masing 4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom dan 4 kali pengulangan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom. Dalam setiap proses pemurnian, setelah dicuci dengan bufer pencuci dilanjutkan dengan elusi menggunakan bufer pengelusi untuk mendapatkan protein fusi MBP-Mga murni. Pada penelitian ini bufer pengelusi mengandung maltosa. Maltosa ini berfungsi untuk memutuskan ikatan antara protein fusi MBP-Mga dengan amilosa. Jadi, maltosa ini dapat berkompetisi tempat dengan ligan terikat (amilosa), sehingga protein fusi MBP-Mga lepas dan selanjutnya keluar bersama eluen. Eluen hasil elusi ini ditampung sebagai fraksi-fraksi. Fraksi yang diambil setiap kali pemurnian adalah 10 fraksi, dengan volume tiap fraksi adalah 1,5 ml. Fraksi hasil elusi dimonitor dengan pengamatan absorbansi pada panjang gelombang 280 nm3). Hasil pengukuran serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa yangJMS Vol. 10 No. 1, Maret 2005 33
sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom untuk 4 kali pengulangan ditunjukkan pada Gambar 1. Gambar 1.a adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 μg/ml); Gambar 1.b adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein


Gambar 1. Pengukuran serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga pada panjang gelombang 280 nm, hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa (dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom)
(a) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 μg/ml); (b) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,890 μg/ml); (c) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,901 μg/ml); dan (d) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,898 μg/ml).

Hasil pengukuran serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa yang sebelumnya dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom untuk 4 kali pengulangan ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar 2.a adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 μg/ml); Gambar 2.b adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,890 μg/ml); Gambar 2.c adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,901 μg/ml); dan Gambar 2.d adalah serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,898 μg/ml).


Gambar 2. Pengukuran serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga pada panjang gelombang 280 nm, hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa (dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom)
(a) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,897 μg/ml); (b) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,890 μg/ml); (c) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,901 μg/ml); dan (d) Serapan fraksi-fraksi protein MBP-Mga hasil pemurnian dari 3 ml protein ekstrak kasar E. coli pMALMga (1,898 μg/ml).
Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom terdapat pada fraksi ketiga sampai kelima, sedangkan protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom terdapat pada fraksi ketiga sampai ketujuh. Munculnya puncak pada grafik serapan fraksi-fraksi protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian tergantung pada bufer pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan ikatan antara ligan (amilosa) dengan protein fusi MBP-Mga, maka akan terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar5. Selain itu, volume matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang ada semakin banyak. Jadi, semakin besar volume matriks semakin lebar puncak serapan, sehingga protein MBP-Mga yang dihasilkan lebih banyak. Dari data hasil penelitian, diketahui bahwa pemurnian protein fusi MBP-Mga dengan teknik kromatografi afinitas menggunakan kolom resin amilosa memberikan hasil yang reprodusibel.
Analisis SDS-PAGE dilakukan untuk melihat hasil pemurnian dengan kolom resin amilosa. Protein yang digunakan sebagai pembanding terhadap protein MBP-Mga murni hasil pemurnian adalah protein marker, dan protein ekstrak kasar E. coli pMALMga yang diinduksi selama 2 jam dengan IPTG 0,3 mM dalam medium LB yang mengandung 0,2% glukosa. Elektroforegram sampel protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian memberikan satu pita dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa, untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom (Gambar 3.b jalur 3). Sedangkan untuk yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom masih ada sedikit kontaminan (Gambar 3.a jalur 1).

Gambar 3.b jalur 3 menunjukkan bahwa protein fusi MBP-Mga yang diperoleh melalui pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas cukup murni, karena memberikan satu pita pada 104 kDa.



Gambar 3. Elektroforegram protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 50X volume kolom (a), Elektro foregram protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom (b).
(a) 1 = Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian; 2 = Protein ekstrak kasar E. coli pMALMga yang diinduksi selama 2 jam dengan IPTG dalam medium LB + 0,2 % Glukosa; 3 = Protein marker, dan (b) 1 = Protein marker; 2 = Protein ekstrak kasar E. coli pMALMga yang diinduksi selama 2 jam dengan IPTG dalam medium LB + 0,2 % Glukosa; 3 = Protein fusi MBP-Mga hasil pemurnian.

Perbandingan kadar protein ekstrak kasar E. coli pMALMga dan protein MBP-Mga murni hasil pemurnian yang menggunakan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom, dapat dilihat pada Tabel 1. Ternyata hasil pemurnian protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom memberikan kadar yang hampir sama, tetapi pemurnian protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom memberikan hasil yang lebih murni, karena pada elektroforegram memberikan satu pita dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa (Gambar 3.b jalur 3). Protein Mga yang difusikan dengan protein MBP terdiri dari 533 asam amino dan pI 5,88 8).

Tabel 1. Protein MBP-Mga hasil pemurnian setelah dicuci dengan bufer pencuci 100X dan 50X volume kolom














Kesimpulan
Protein fusi MBP-Mga telah berhasil dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas dengan kolom resin amilosa pada kondisi pH 7,4 dengan bufer pencuci (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, dan EDTA 1 mM) dan bufer pengelusi (Tris.Cl 20 mM pH 7,4, NaCl 0,2 M, 2-merkaptoetanol 10 mM, EDTA 1 mM, dan maltosa 10 mM). Proses pemurnian untuk protein fusi MBP-Mga yang dicuci dengan bufer pencuci 100X volume kolom memberikan hasil terbaik, hal ini dibuktikan oleh data analisis SDS-PAGE terhadap protein fusi MBP-Mga menunjukkan adanya pita tunggal dengan massa molekul relatif sekitar 104 kDa.
 
BAB III
PENUTUP
Kesimpulan:
Jurnal yang kami angkat sebagai makalah mempunyai kesimpulan bahwa dalam penelitian tersebut dalam penggunaan kromatografi kolom berhasil dilakukan dengan menggunakan kromatografi afinitas dengan kolom resin amilosa. Prinsip dasar dari kromatografi kolom ini adalah pengikatan spesifik ligan dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik tidak dapat dilakukan pemurnian satu tahap.
 

DAFTAR PUSTAKA

Marrozaq, Dendy Nur dkk. Kromatografi Kolom. 2009. Jakarta: Erlangga
Muhaimin, Oei Ban Liang, Enny Ratnaningsih, Endang Purwantini. Purifikasi Protein Fusi MBP-Mga Streptococcus pyogenes Hasil Ekspresi Heterolog di Escherichia coli. 2005. Jurnal Matematika dan Sains. Vol. 10 No. 1, Maret 2005, hal 31-36.
Putra, Effendy De Lux. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera Utara. © 2004 Digitized by USU digital library.

lonely

Lonely im so lonely,
I have nobody,
To call my owwnnn
Im so lonely, im mr. Lonely
I have nobody,
To call my owwnnn
Im so lonely,
Yo this one here goes out to all my playas out there ya kno got to have one good girl whose always been there like ya
Kno took all the bullshit then one day she cant take it no more and decides to leave
I wont up in the middle of the night and I noticed my girl wasn’t by my side, coulda sworn I was dreamin, for her I was
Feenin, so I hadda take a little ride, back tracking ova these few years, tryna figure out wat I do to make it go bad, cuz
Ever since my girl left me, my whole left life came crashin
Im so lonely (so lonely),
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody)
To call my own (to call my own) girl
Im so lonely (so lonely)
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody)
To call my own (to call my own) girl
Cant belive I hadda girl like you and I just let you walk right outta my life, after all I put u thru u still stuck
Around and stayed by my side, what really hurt me is I broke ur heart, baby you were a good girl and I had no right, I
Really wanna make things right, cuz without u in my life girl
Im so lonely (so lonely)
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody to call my own)
To call my own (to call my own) girl
Im so lonely (so lonely)
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody)
To call my own (to call my own) girl
Been all about the world ain’t never met a girl that can take the things that you been through
Never thought the day would come where you would get up and run and I would be out chasing u
Cuz aint nowhere in the globe id rather be, aint noone in the globe id rather see then the girl of my dreams that made me
Be so happy but now so lonely
So lonely (so lonely)
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody)
To call my own (to call my own)
Im so lonely (so lonely)
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody)
To call my own (to call my own) girrll
Never thought that id be alone, I didnt hope you’d be gone this long, I jus want u to come home, so stop playing girl and
Come on home (come on home), baby girl I didn’t mean to shout, I want me and you to work it out, I never wished Id ever
Hurt my baby, and its drivin me crazy cuz….
Im so lonely (so lonely)
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody)
To call my own (to call my own)
Im so lonely (so lonely)
Im mr. Lonely (mr. Lonely)
I have nobody (I have nobody)
To call my own (to call my own) girll
Lonely, so lonely
So lonely, (so lonely),
Mr. Lonely, so lonely
So lonely, so lonely, (so lonely), Mr. Lonely